大鼠脑中清脑宣窍方栀子苷等3个指标性成分的高

  大鼠脑中清脑宣窍方栀子苷等3个指标性成分的高效液相色谱分析的论文

  【摘要】 目的建立大鼠脑中清脑宣窍方有效部位中3个指标性成分栀子苷□☆☆、人参皂苷rg1□□☆□、rb1的hplc浓度测定方法☆☆□。方法大鼠脑样品取出□☆☆□,洗去残血□☆□、匀浆☆☆☆☆□、甲醇提取□□☆☆、离心口口后口水溶☆□□☆□,用c18固相萃取柱处理☆□□,以亥茅酚苷为内标☆□□□☆,选用色谱柱:agilent eclipse xdb-c18(4.6 mm×250 mm☆□□,5 μm)□□☆☆□,eclipse xdb-c18保护柱☆□□□☆。流动相为乙腈-甲酸水二元梯度洗脱☆□□□☆,柱温为30℃☆□□,流速为1.0 m口l/min□□☆□☆,检测波长为203 nm□□□。结果各成分的最低检口测限口(s/n>3)在0.16~1.1 口mg/口l口之间,平均回收率均在90%以上,日内☆□□☆、日间精密度及稳定性口的r口sd均小于10%☆☆□☆。结论该方法简便□☆□☆、准确□☆☆,可用于脑组织中清脑宣窍方有效部位栀子苷☆□□、人参皂苷rg1□□☆☆、rb1 3种成分定量分析☆□☆。

  【关键词】 清脑宣窍方; 栀子苷; 人参皂苷rg1; 人参皂口苷rb1; 高效液相色谱

  quantitative determination of 3 main components in effective fraction 口of qingnao口xuanqiao口 formula in sd rat brain by rp-hplc

  abstract:objectiveto establish a method for determination of the concentrations in rat brains of geniposide, ginsenoside rg1 and ginsenoside rb1 by hplc in the effective fraction of qingnaoxuanqiao formula. methodsthe rat brain samples were taken out, cleaned remaining 口blood, smashed into pl口asm , extracted口 by meoh, and dissolved by water aft口er ce口ntrifuging. a column of c18 solid phase was used for the extraction and sec-o-glucosylhamaudol was taken as internal standard. the procedure was carried out on a chromatography column of agilent eclipse xdb-c18 chromatography column (4.6 mm×口250 mm, 5 μm) and a protective column of eclipse xdb-c18. the mobile phase was a binary gradient elution of ethane nitrile to acid water and the column temperature was 30℃. the flow rat口e was口 1. 0 ml /min and the detection wavelength was 203 nm.resultsthe lowest testing concentration of each co口nstituent ( s/n > 3) was from 0. 16 to口 口1. 1 mg口/l. the average 口r口ecovery was above 口90%. rsds of accuracy and stability in intra-day and inte口r-day were all below 10%. conclusionthe method is easy and accur口ate, which can be used in the quantitat口ive an口alysis of 3 constituents in the eff口ective fraction of qingnaoxuanqiao formula in brain tissue.

  k口ey words:qingnaoxuanq口iao formula; gen口iposide; ginsen口oside rg1; ginsenoside rb1; hplc

  清脑宣口窍方为王永炎院士救治脑中风临床经验方☆☆☆□□,由栀子☆☆☆□、三七等中药口口组成☆☆□□。wwW.11665.CoM本方及其口有口效部位具有口清热解毒☆☆☆☆、宣窍活络的作用☆□☆□,对于缺血性脑中风具有显著的疗效[1,2]□☆□□☆。栀子苷☆☆□,人参口皂苷rg口1☆☆☆□,rb1为该方主口要药效成分[3,4]☆□□☆☆。为了解其在体内的分布及代谢情况,本文建立了hp口lc同时测定清脑宣窍方口有效口部位中3种成分在脑组织中的浓度测定方法☆□☆□☆。

  1 仪器与试药

  waters 2695高效液相色谱仪□□□□,2696d口ad检测器□☆□☆,自动进样☆□□,sartorious bt 25s型1/100000电子口分析天平(北京赛口多利斯仪器有限公司)☆□□☆,kq-500de型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);ql-901漩涡混和机(其林贝尔仪器口制造公口司);cleanert c18 spe口固相萃取柱(3 ml□☆☆,200 mg☆☆☆,60 口μm□□☆☆,北京艾杰尔科技口有限公口司)☆□☆☆。

  栀子苷☆□□□,人参口皂苷rg1☆☆□、rb1对照品(批号分别口为:110749-200309□☆☆,110703-口200322□□□□,110745-口200312)购自中国药品生物制品检定所□☆□□□,亥茅酚苷对照品由北京口中医药大学药化室提供□□□。

  清脑宣窍口有效组分(由栀子和三七药材混合提取再经大孔树脂富集后按比例加入天然冰片制备而成□□☆☆,自制)☆☆□□☆。乙腈(fisher公司)□□☆,色谱纯;屈臣氏重蒸水;其他试剂均为分析纯□□☆□。

  s口口d大鼠,体质量为(300±10)g□□☆☆,雄鼠(由北京市维通利华实验动物技术有限公司提供)☆☆□。

  2 方法口与结果

  2.1 给药方法及脏器处理健康sd大鼠☆□□,用药前禁食18 口h□□☆☆□,单剂量灌口服清脑宣窍有效部位口(6 g/kg),于给药后60 min取出脑□□☆☆,生理盐水口浸口泡,洗去残留血液,-40℃保口存备口用□☆□☆。

  2.2 对照品溶液和口内标溶液的口制备精密称取栀子苷□☆☆☆,人参皂苷口rg1□☆□☆□、rb1对口口照口品□☆☆☆□,置25 ml量口口瓶中□□□,加水制成一定浓度混合口对照品储备口液□□☆☆□,临用时□□☆☆,用水稀释成标准系列浓度的对照品混合溶液;精密称取亥茅酚苷5 mg□□☆☆,置100 ml量瓶口内□□□,加水稀释至刻度☆☆□□☆,摇匀□☆☆□☆,得浓口度为口0.05 g/l口的内标溶液□☆□□。

  2.3 心脏样品口处理取单个心脏□☆□,吸干水分□☆□☆□,精密称重□□☆,加入口重口量两倍体积的生理盐水☆□☆□,口☆口口☆口以口18 000 r/min匀浆□☆☆。匀浆液口加入两口倍体积的分析甲醇及0.025 ml内标,涡旋口振荡10 min,混合液在6 000 r/min下离心20 min,取出上口清液☆□☆□,残渣再加入两倍体积甲口醇☆□□☆,漩涡振荡10 min, 6 000 口r/min下离心20 min,两次上清液混合,常温减压回收至干☆□□☆☆。残渣用5 ml液相水溶解□☆□,超声振荡□□☆☆,上spe固相口萃取柱☆☆□☆□,先用水洗脱3 ml□□☆☆□,再用甲醇洗口脱2 ml□☆□□,收集甲醇洗脱液☆□☆,常温减压干口燥☆□□□☆,残渣加甲醇口口300 μl漩涡溶解□□☆,即得供试品溶液□□☆☆☆。

  2.4 口色谱条件及系统适应性

  2.4.1 色谱条件色谱柱为口agilent eclipse xdb-c18(4.6 mm口×250 mm☆□□☆,5 μm);保护柱:eclips口e xdb-c18;柱温30℃;流速1.0 ml/min;检测波长203□□☆,238 口n口m;洗脱梯度:乙腈(a)口-甲口酸水口(b):5%a17 min→16%a 23 min→ 16%a 28 min→口 20%a 34 min→ 22%a 50 min→ 30%a 65 min→ 45%a 80 min→100%a

  2.4.2 检测波长的口选择取清脑宣窍方口有效部位适量☆☆□☆,用甲醇稀释后□☆□☆☆,以甲醇为空白□☆□,在200~400 nm范围扫描测定紫外吸收光谱□☆☆,结果样品口在该范围内口有两个明显的吸收峰☆□☆☆□,最大口吸收波长分别为203☆□□☆☆,238 nm☆☆□□□。结果见图口1□☆□□□。

  图1 清脑宣窍方有效部位紫外吸收图

  精密吸取10 μl栀子合三七供试品溶液注入高效液相色谱仪□☆□□☆,按上述色谱条件分别在203 nm及238 nm检测□☆☆□☆,结果在203 nm波长下□☆□☆,基本包括了238 nm波长下所有色谱峰□☆□☆。因此□□□☆,确定203 nm为清脑宣窍方供试品溶液hplc紫外检测波长□□□☆☆。

  2.4.3 系统口适应口性在上述条口件下分别精密吸取对照品混合溶液(包括内口标);空白心;空白心加对照品及含药脏器供试品口溶液各10 μl☆□□☆☆,进样测定□☆☆☆。结果表明在对照品溶液和含药脏器供试品溶液色谱图相应位置上□☆☆□□,有相同保留时间的色谱峰☆☆☆☆,且空白心脏样品无干扰☆□□。结果口见图2□□□。

  2.5 标准口曲线制备及最低检测口口限测定口取空白脑☆□□☆,按“2.3”项下方法口取口材并匀浆口口后,分别加入7个高低不同浓度混合对照品溶液各5份,而后按“2.3”项下方法同量加入甲醇沉口淀蛋白☆☆□☆□,混匀□☆□☆、离心并回收上清口液口口至干,5 ml屈臣氏水溶解,并通过固相萃取柱☆□□□□,水□☆□、甲醇口依次按口量洗脱□□☆,甲醇洗脱口液蒸干☆□□,300 口μl甲醇涡旋溶解成口供试液☆☆□☆□。以各对照口品色谱口峰峰面积as与内标色谱峰峰面积ai比值as/ai为纵坐标☆□☆□,对照品口口浓度为横坐标☆☆□□□,绘制口标口准曲线并进行线性回归□□☆,得回归方程及定量限(loq)☆☆□□□,再以信噪比(s/n〉3)分别测得最低检测限(lod)□☆☆□。结果见表1□☆□☆□。表1 标准曲线制备及最低检测限确定

  2.6 口精密度实验取空白脑脏器液□☆☆☆□,加入混合对口照品溶液0.1 ml☆□□☆,制成高□☆☆□☆、中□☆☆、低3个浓度的口样品☆☆□,按“2.3”项下口方法处理口口口后☆☆□,日内每个浓度测定5次☆□☆□,测定各对照口品峰面积as及内标峰面积ai□□□,通过口峰面积比值as/ai计算各对照品的组织浓口度及rsd□□☆,结果表明日内精口密度良好;连续测定5 d,同法计算各对照品的浓度及rsd□□☆☆□,结果表明日间精口密度口良好□□☆☆。结果见表口2☆□□。

  2.7 脑组织口回收率实验取空口白脑匀浆液□☆☆☆☆,加入混合对照品溶液0.1 ml☆□☆□,制成高☆□□、中□☆☆、低3个浓度的口口脑样品□□□☆☆,每个浓度各口5份□□☆☆□,按“2.3”项下方法口操作☆□□,测定对照品峰口面积as和内标峰面积ai☆☆☆□,计算比值as/ai☆☆□□,口☆口口☆口标准曲线法计算口口浓度☆□□☆,所得浓度与实际浓度比值即为方法回收率;测得各对照品峰面积与相应浓度对口照品峰面积的比值□□☆,即为萃取回收率□☆□☆☆。结果口口见表3☆□☆☆□。

  2.8 脑组织稳定性实验取一定量空白脑匀浆液□☆□,按比例加入混合对照品溶液□□□,制成高□□☆☆☆、中□□□☆☆、低3个浓度口口样品☆□□□,每个浓度口分口成2份□□☆□□,1份室温放置☆□☆□,另1份于-40℃条件下保存☆☆□☆☆。取室温口口样品☆☆□☆□,每隔1 h吸取5 ml☆☆□□☆,按“2.3”项下口口口口口方口法操作□☆☆,测定各对照品峰面积as及内标峰面积a口i☆□☆□,通过峰面口积比值as/ai计算各对照品的脑组织浓度及rsd□☆☆,结果表明心脏匀浆液样品室温放置5 h稳定性良好;取冷冻口脏器口样口品□□□☆,解冻后按上述方法处理测定□□☆□,再冷冻☆□□,10 d内依法测定3次□☆☆,结果表明心脏样品冻融稳定性良好□□□☆□,且样品在-40℃口条件下保存10 d基本稳定□☆☆。结果见表4☆☆☆□。表2 脑组织精密度实验表3 脑组织回收率实验表4 脑组织稳定性实验

  2.9 口清脑宣窍方脑样品含量测定取6 g/kg给药后60 min脑样品☆□□,按“2.3”项下口方口法口口操口作☆□☆,吸取10 μl进样□□□,以随行的标准曲线计口算浓度□☆□☆。结果口见表口5□☆□☆☆。表5 60 min脑组织样品含量测定结果

  3 讨论

  生物样品含有许多内源性的杂质□☆☆□☆,口☆口口☆口脏器组织含有大量的蛋白质□□☆☆、脂肪□□□、核酸等成口口分☆□□☆☆,在测定过程中能形成泡沫☆☆□、浑浊口或沉淀□☆☆□,并且有时还会与加入口的试剂反应☆□□,从而口干扰分析;蛋白质等还会污染仪器和恶化口测定条件☆☆☆☆,如果直接进样用液相色谱分析含蛋白的体液样品时□☆☆,蛋白质口会逐渐沉结口在色谱柱上□☆☆☆□,影响柱效□☆☆,导致柱压口上升☆□□,最终无口法使用□☆□,所以脏器样品必须进行合理的前处理;另外☆☆□,有效成分可以跨膜口转运至口组织细胞内☆☆□,也可存口在于组织液中☆□□,在测定前组织必须粉碎☆□□☆,才能使有效化学成分能充分溶出☆☆□☆,得到确口定口口结果□☆□。我们对脏器在前处理过程上总结出以下方法:匀浆□☆□☆☆,有机试剂沉淀蛋白□☆☆□,高速离心分离沉淀口物□□□□☆,回收有机口试剂□☆☆,c18 spe口固相萃取柱处理等步骤□☆□☆□。实验证明☆□□,该方法操口作口口简单□☆☆□,回收率合适☆☆□□,是一种有效的脏器口前处理方法☆☆□。

  生物样品用色谱法分析时通常要采用纯化☆□☆☆□,浓缩口等预处理☆□□□☆,而各步骤操作又难以做口到完全口口的平行一致□☆☆☆□,所以生物样品一般均采用内标法定量□☆☆□□。根据选择内标的最基本的原口则☆☆□,我们曾考口察了芍药苷☆☆☆、橙皮苷☆□☆□☆、亥茅酚苷等口化合口物☆□□□☆,最后选择了口亥茅酚苷☆☆☆□,其在色谱图中出峰时间与人参皂苷rg1接近□□☆,并且在血清样品的前处理过程口中保留行为与四成分相似☆□□,回收口口率大于85%☆☆□□。

  清脑宣窍方有效成分中栀子苷对心脏作用表现为降低心口肌收缩力[5];人参皂苷rb1对心肌收缩有抑制作用[6];人参皂苷rg1对大鼠心肌细胞l□☆☆、t型口钙通道有口阻滞作用[7]☆☆☆□。本次实口验证明,脑中口均能通过液相检测到该种成分□☆☆☆□,为研究提口供了一定口的依据□☆☆。

  本文建立了hplc法同时测定清脑宣窍方中3种成口分的脑浓度方法☆☆□☆。测定结果表明,建立的方法准确可靠☆☆☆□☆、灵敏度高,可较好地用于清脑宣窍方脑组织药代动力学研究☆□☆□☆。

  【参考文献】 [1] 韩振蕴,张允岭,石任兵,等.清脑宣口窍滴丸治疗急性期腔隙性脑梗死66例临床观察[j].辽宁中口医杂口志,2007☆□□,34(4):433.[2] 口口柳口洪口胜,张允岭,刘雪梅,等.清脑宣窍滴丸对口大鼠局灶脑缺血再灌口注炎症因子含量的影响[j].中华中医药杂志□□□☆□,2007,22(5):328.[3] 陈玉平,石任兵,刘 斌,等.hp口lc口法测定清脑宣窍方有效部位中人参皂苷口r口g1☆☆☆□□、rb1及三七皂苷r1的含量[j口].北京中医药大学学口报, 2007,30(1):54.[4] 陈玉平,石任兵,刘 斌,等.rp-hplc法测定清脑宣窍口方口有效部位中口藏红花酸含量[j].北京中口医药大学学报, 2004,27(3):63.[5] 田智勇□□□☆,于培明□□☆,许启泰.中药栀口子的研究进展口[j口].时珍国医国药□□□□☆,2004,15(口口11):782.[6] 孙晓口霞,夏映红,钟国赣.人参皂苷单体rb1对大鼠在体心脏收缩性能的影响[j].长春口中医学院口口口学报, 2003,19(1):43.[7]口 吕口口青口口远.三七叶苷口的化学口成分及药理口作用[j].时珍国医国药,2006,17(10):2065.

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